PCR (uuring) - rakendus. Mis on PCR tehnika?

PCR on test, mida on kasutatud paljude haiguste diagnoosimisel. PCR-meetod võimaldab näidata bakterite otsest olemasolu organismis ja täpsemalt selle DNA-d. Muu hulgas kasutatakse PCR-testimist puukborrelioosi diagnoosimisel. Mis on PCR tehnika? Mis on reaalajas PCR?

Sisukord:

1. PCR (testimine) - mis on PCR tehnika?
2. PCR (uuring) - PCR-meetodi rakendamine
3. PCR (uuring) - puukborrelioos
4. PCR (uuring) - tulemused. Kas need võivad olla valepositiivsed?
5. PCR (uuring) - tulemused. Kas need võivad olla valenegatiivsed

PCR (polümeraasi ahelreaktsioon) on põhimeetod, mida kasutatakse geneetilistes ja molekulaarsetes laborites. Selle töötas välja 1983. aastal Kara Mullis, kellele anti selle eest 1993. aastal Nobeli preemia.

Kuulake, mis on PCR-testimise tehnika. See on tsükli KUULAMISE HEA materjal. Podcastid koos näpunäidetega.

Selle video vaatamiseks lubage JavaScripti ja kaaluge üleminekut veebibrauserile, mis toetab HTML5-videot

PCR (testimine) - mis on PCR tehnika?

PCR testimine koosneb spetsiifilise DNA fragmendi, näiteks Borrelia valke kodeerivate geenide, mitmekordsest amplifitseerimisest (tavaliselt 30–40 tsüklit), kasutades polümeraasi ensüümi.

Seejärel kasutatakse amplifitseeritud DNA fragmendi nähtavaks tegemiseks spetsiaalseid molekulaarseid värvaineid. Spetsiifiliste DNA fragmentide amplifitseerimise tõttu on PCR ülitundlik meetod.

PCR-meetodil amplifitseeritakse DNA fragmendid, kasutades spetsiifilisi praimeripaare bakteri DNA antud piirkonnas. Näiteks puukborrelioosi diagnoosimisel kasutatavad PCR-i sihtpiirkonnad on valke kodeerivad geenid, nt. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.

Bioloogiline materjal, millest testi saab teha, on:

• veri
• rände erüteemi nahalõik
• tserebro-seljaaju vedelik
• sünoviaalvedelik või liigesekõhre
• uriin

PCR (uuring) - PCR-meetodi rakendamine

Lisaks borrelioosi diagnoosimisele PCR-meetodil on võimalik tuvastada teiste mikroorganismide või inimeste spetsiifilisi DNA fragmente. Seetõttu kasutatakse PCR-meetodit ka:

• viirusnakkuste diagnostika ja seire: herpesviirused (herpes, herpes zoster, Epstein-Barr, tsütomegaloviirus), HIV, hepatiidiviirused (HBV ja HCV)
• bakteriaalsete infektsioonide diagnostika ja jälgimine, eriti nende bakterite puhul, mida ei saa kultuuride kaudu tuvastada, nt tuberkuloos
• neoplastiliste haiguste diagnostika ja jälgimine: leukeemia, rinnavähk, pärasoolevähk, kopsuvähk
• vähi eelsoodumuse diagnoos: rinna- ja munasarjavähk (geenid BRCA1 ja BRCA2), pärasoolevähk (APC ja CHEK2 geenid)
• geneetiliste haiguste diagnostika: hemokromatoos (HFE geen), talasseemia (HBA1 ja HBA2 geenid), tsöliaakia (HLA geenid)
• isadustestid, mis tuvastavad lapse ja isa DNA ühilduvuse

Loe ka: puukborrelioosi testid - kuidas need välja näevad ja mis on puukborrelioosi testide hind Western Western blot test ja puukborrelioos. Testi tulemuste tõlgendamine Puugiga levivad haigused: borrelioos, babesioos, bartonelloos, TBE jt.

Praegu on PCR-meetodil palju modifikatsioone. Näiteks puukborrelioosi diagnoosimisel kasutatakse peamiselt pesastatud PCR-i (sisestatud PCR) ja reaalajas PCR-i meetodeid. Viimane on kvantitatiivne meetod ja võimaldab määrata Borrelia DNA koopiate täpse arvu testitud bioloogilises materjalis.

PCR (uuringud) ja puukborrelioos

Borrelioosi diagnoosimise aluseks on seroloogilised testid. Siiski on kliinilisi olukordi, mis võivad põhjustada nende testide valenegatiivsuse:

• seroloogiline aken, see tähendab nakatumise algusperiood, mille jooksul keha ei tooda veel spetsiifilisi IgM ja IgG antikehi Borrelia spirochetes'e vastu
• immuunpuudulikkusega inimestel, kes ei tooda piisavalt antikehi
• immuunkomplekside olemasolu, mis koosnevad Borrelia antigeenidest ja nende spetsiifilistest antikehadest ning takistavad antikehade tuvastamist seroloogiliste meetoditega

Kui patsiendil kahtlustatakse puukborrelioosi sümptomeid ja seroloogiliste testide tulemused on negatiivsed, saab teha PCR-meetodil põhinevaid molekulaarseid katseid.

Borrelia spiroheetide DNA-d saab tuvastada nakkuse varases staadiumis, kuna spiroheetide arv on siis kehavedelikes kõige suurem.

Borrelioosi diagnoosimisel kasutatakse peamiselt seroloogilisi meetodeid nagu ELISA, kuid mõnes kliinilises olukorras on abiks PCR-meetodit kasutavad geneetilised testid.

Mida pikem on aeg nakatumisest, seda väiksem on tõenäosus bakterite DNA tuvastamiseks. Seetõttu kasvatatakse mõnel juhul enne PCR-testi tegemist baktereid spetsiaalsetes söötmetes 1-2 nädalat ja seejärel tehakse test.

Seda lähenemist kasutatakse puukborrelioosi ja korjatud tserebrospinaalvedeliku kahtluse korral. Nakkuse hilises faasis on sobivam teha ELISA test.

PCR-meetodit ei tohiks kasutada puukborrelioosi rutiinses diagnoosimises, kuna Borrelia burgdorferi sortide esinemine Poolas ei ole standardiseeritud.

Diagnoosimisraskuste korral (eriti haiguse varajases staadiumis) aitab PCR-testi tulemus diagnostilist protsessi.

Positiivne testi tulemus tähendab, et testitud materjalis tuvastati Borrelia burgdorferi DNA ja selle sortide olemasolu, kuid see ei selgita, kas kehas toimub aktiivne nakkus. Teiselt poolt ei välista negatiivne tulemus bakterite olemasolu organismis.

Mõned laborid pakuvad Borrelia DNA olemasolu uurimist puugis. Kuid sellise uuringu tulemus ei ole hammustatud inimese puukborrelioosi diagnoosimise aluseks.

Soovitatav artikkel:

ELISA test - mida see tuvastab? Kuidas tulemusi lugeda? Testi hind

PCR - tulemused. Kas need võivad olla valepositiivsed?

PCR on ülitundlik meetod ja samal ajal väga tundlik saastumise suhtes. Seetõttu on PCR-põhiste testide puhul väga oluline valida sobiv sisekontroll valepositiivsuse välistamiseks.

Peamine on ka testimiseks vajaliku materjali õige kogumine ning testi sooritava diagnostiku kogemus ja usaldusväärsus.

PCR - tulemused. Kas need võivad olla valenegatiivsed

Nagu igas laborikatses, ka PCR-meetodis, võivad ilmneda valenegatiivsed tulemused. Siin on ülitähtis vere kogumine sobiva antikoagulandi jaoks, kuna mõned neist, näiteks hepariin, võivad PCR-reaktsiooni pärssida.

Samuti võib materjali kogumine pärast antibiootikumravi alustamist põhjustada PCR-reaktsiooni efektiivsuse vähenemist ja valenegatiivsete tulemuste suuremat tõenäosust.

Samuti tuleks meeles pidada, et Borrelia bakterid elavad veres ja kehavedelikes väga lühikest aega, sest tänu spetsiaalsetele retseptoritele tungivad nad väga kiiresti keha raskesti ligipääsetavatesse kohtadesse.

Seetõttu on erinevalt teiste mikroorganismide diagnostikast Borrelia spiroheetide arv bioloogilises materjalis väike, mõnikord isegi PCR-meetodi avastamise piiril. See võib põhjustada ka valenegatiivi.

Soovitatav artikkel:

Lümfotsüütide transformatsiooni test (LTT)

Kirjandus

1. Dunaj J. et al. PCR-meetodi tähtsus Lyme borrelioosi diagnoosimisel. Sirvige Epidemiool. 2013, 67, 119 - 123.
2. Puukide kaudu levivate haiguste laboridiagnostika. Töörühma soovitused: Riiklik laboridiagnostikute koda, Riiklik rahvatervise instituut-riiklik hügieeniinstituut, nakkushaiguste valdkonna riiklik konsultant, nakkushaiguste ja neuroinfektsioonide osakond, Białystoki Meditsiiniülikool, Poola Viroloogia Selts, Varssavi 2014.
3. Ružić-Sabljić E. ja Cerar T. Lyme'i tõve molekulaarse diagnoosimise edenemine. Ekspert Rev Mol Diagn. 2017 jaanuar; 17 (1): 19-30.
4. Valones M.A.A. jt. Polümeraasi ahelreaktsiooni põhimõtted ja rakendused meditsiinidiagnostikas: ülevaade. Braz J mikrobiol. 2009 jaanuar-märts; 40 (1): 1–11.

Autori kohta

Karolina Karabin, MD, PhD, molekulaarbioloog, laboridiagnost, Cambridge Diagnostics Polska Mikrobioloogia erialale spetsialiseerunud bioloog ja laboridiagnost, kellel on üle 10-aastane laboritöö kogemus. Molekulaarmeditsiini kooli lõpetanud ja Poola inimgeneetika seltsi liige, Varssavi Meditsiiniülikooli hematoloogia, onkoloogia ja sisehaiguste osakonna molekulaardiagnostika laboratooriumi uurimistoetuste juht. Ta kaitses Varssavi Meditsiiniülikooli 1. arstiteaduskonnas arstiteaduse doktori nimetust meditsiinibioloogia alal. Paljude teadus- ja populaarteaduste autor on laboridiagnostika, molekulaarbioloogia ja toitumise valdkonnas. Igapäevaselt juhib ta laboridiagnostika valdkonna spetsialistina Cambridge Diagnostics Polska sisulist osakonda ja teeb koostööd CD-dieedikliiniku dietoloogide meeskonnaga. Ta jagab oma praktilisi teadmisi haiguste diagnostika ja dieetravi kohta spetsialistidele konverentsidel, koolitustel ning ajakirjades ja veebisaitidel. Teda huvitab eriti tänapäevase elustiili mõju keha molekulaarsetele protsessidele.